白癜风多少钱 http://pf.39.net/bdfyy/bdfal/180627/6358226.html氨基酸螯合钙中的钙元素嵌合在各氨基酸分子之间，不会与食物中的植酸、草酸、胃酸和碱性物质发生反应，从而影响人体吸收。氨基酸螯合的钙直接通过肠黏膜吸收，可增加其生物利用度。然而，过量摄入氨基酸会导致体内负氮平衡，从而影响人体的生理功能并导致各种不良后果。与氨基酸相比，Plastein反应提供了一种可能的方法，以合成具有所需生物利用度，安全性和功能特性的多功能肽基成分。肽螯合钙具有较高的溶解度，在弱碱性环境中胃肠道pH值为7.2时具有良好的稳定性，可以有效地转运钙离子并通过肠上皮细胞进行吸收和利用，且吸收不易受食品成分的影响进而增加了钙的生物利用效率。因此，肽钙螯合物可能更适合于膳食钙补充剂，以增强钙的元素在人体中的消化吸收。
欧洲鳗鱼骨约占活鳗鱼质量的10%，是鳗鱼生产中的主要副产品。有报道表明源自鱼骨的肽对钙螯合能力较高，并可以改善钙的吸收和生物活性。鳗鱼骨因其低成本、高蛋白含量、高无机盐和高可用性而有望成为钙结合肽的良好来源。目前，鳗鱼骨肽的生物活性鲜见报道。鱼骨是鳗鱼加工的副产品，具有很高的营养价值和利用价值，但现仅用于制造低附加值的产品，例如骨胶、动物饲料或手工艺品。
因此，福建农林大学食品科学学院的钱跃威、徐瀚麟和陈雷*等人的主要目的是从鳗鱼骨蛋白中优化钙结合肽，并评估针对水溶性钙的体外结合特性。该发现对于利用鳗鱼骨中的肽作为功能性补品中的生物活性肽成分将有很大帮助。
1不同蛋白酶工艺对欧洲鳗鱼骨水解的影响
结果显示，在三酶处理中，鱼骨粉与蒸馏水料液比1∶8（g/mL）、酶剂量U/g。双酶同时水解（同时添加胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）中两种酶的添加比例为1∶1（酶活性比），双酶同时水解中2种酶的水解时间比例为1∶1（首先用胃蛋白酶水解底物，然后用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶水解，或者3种酶同时进行水解），发现3种酶的协同作用显著改善了由单酶或双酶产生肽的钙结合能力，肽的最佳钙螯合率为35.78%。此外，3种酶协同作用后蛋白质的肽键逐渐断裂，分解成肽和氨基酸，导致水解物的水解度和肽产量显著提高（P＜0.05）。研究最佳水解条件如下：鱼骨粉与蒸馏水料液比为1∶8（g/mL），酶剂量为U/g（胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均为U/g），分别在37℃和不同pH值环境下放置4h。
2工艺条件对EBCP-Ca螯合率的影响
钙结合能力随质量比的不同而变化（图1A）。当多肽与钙质量比从1∶2增加到5∶1时，钙结合能力从42.65%显著增加到84.01%（P＜0.05）。图1B表明，随着温度的升高，钙的螯合速率逐渐增加，当反应温度为50℃时，结合能力最高，再随着温度的升高，螯合物的结构稳定性变差，与钙离子的结合能力逐渐变低。当螯合时间从20min延长到60min时，螯合率从77.63%增加到82.71%（图1C），并且随着时间延长到min无显著差异（P＞0.05），这表明肽与钙的螯合反应快，类似于乳清太平洋鳕鱼与钙的结合。当pH值从4.5增加到7.5时，钙结合能力逐渐增加，并且在pH7.5时达到最大值（图1D）。这可能是由于pH值和OH-的增加，而H＋和OH-达到了一定的平衡，从而增强了钙离子和NH4＋，—OH和—COOH之间的配位作用。
3荧光光谱测定结果
芳香氨基酸，例如苯丙氨酸和色氨酸可以在特定的激发波长下产生内源性荧光。因此，波长和荧光强度的变化可有效反映有机配体基团与金属离子之间的相互作用（图2）。随着CaCl2质量浓度的增加，在约nm波长处的荧光强度先增加然后减少。荧光强度在约nm波长处显著增加，吸收峰从nm移至nm，结果表明钙离子可能与芳香族氨基酸螯合，导致荧光变化。但添加μmol钙离子以上出现荧光降低，即特定二肽（Phe-Tyr）的内源荧光强度随着钙离子浓度的增加而降低（荧光猝灭），结果表明钙离子的添加引起鳗鱼多肽的折叠和结构变化，反应产生了EBCP-Ca。另一个可能的解释是鳗鱼骨多肽中的发色团与钙离子反应，从而改变了激发态的能量并导致荧光强度降低。
4FTIR测定结果
EBCP和EBCP-Ca复合物的FTIR如图3所示。波数.29cm-1吸收归因于N—H胶原肽的拉伸振动。螯合反应后，能带移至.36cm-1，表示肽中的电子云密度由于诱导效应或偶极场效应而变得更强，表明—NH参与了螯合物的形成。.96cm-1处的吸收带对应于与钙螯合后不移动的肽中的酰胺I带，表明C＝O不参与钙的共价键合反应。.58cm-1和.58cm-1处的COO—谱带转移至.51cm-1和.08cm-1处，表明—COOH可能与钙结合，并且这种类型的螯合剂可能是由于未结合的自由电子所致。将.85cm-1和.48cm-1的条带转移到.99cm-1和.20cm-1，它们属于酰胺III，代表C—N的拉伸振动和N—H的弯曲振动。它主要来自甘氨酸和脯氨酸中的—CH2与钙离子的结合。另外，肽钙螯合物在.00cm-1具有一个新的吸收峰，这在肽谱中不存在。
5SEM结果
SEM是透射电子显微镜和光学显微镜之间的微观形态观察方法，可以直接利用样品表面材料的材料特性进行显微成像。图4A、B分别显示了EBCP和EBCP-Ca复合物的表面形态。EBCP显示出整体的外观和粗糙的表面（图4A）。相比之下，EBCP-Ca表现出致密的颗粒状结构，并且大小分布密集，这与EBCP的外观明显不同（图4B）。
金属离子可以与肽相互作用，并且对肽螯合物有明显的作用。因此，钙离子可以通过加速肽的二聚化和稳定所得的二聚体促进聚集。分子间力、表面张力和各向同性力的影响可能有助于聚集过程，而肽链中的巯基、羧基和氨基则通过水溶液中的分子间氢键形成“盐桥”，从而改变了EBCP的性能。此外，就脱水而言，肽链的氨基酸可与锌离子结合形成环状结构；此后，添加到EBCP的钙离子屏蔽了多肽链上的负电荷，形成了“盐桥”并诱导蛋白质聚集。形态分析结果表明，EBCP与钙离子之间的强相互作用导致形成更紧密的连接颗粒。
6EBCP-Ca的稳定性
EBCP-Ca在特殊pH值和温度下的稳定性如图5A、B所示。在图5A中，5mg/mLEBCP-Ca处于不同pH值（2～12）溶液后，EBCP-Ca钙保留率从对照组（99.08±0.92）%降低至（61.86±0.22）%。在强酸性条件下，钙保留率明显降低（P＜0.05）。在图5B中，随着温度的升高，EBCP-Ca的钙保留率略有下降，并且都保持在78%以上，不同组之间存在不显著差异（P＞0.05），这表明螯合剂对热处理具有一定的抵抗力。
生物活性物质在体外模拟胃和小肠环境的耐受性可用于评估其消化稳定性。EBCP-Ca在胃肠环境中的钙保留率如图5C所示。与模拟胃液水解0h（pH2，不添加胃蛋白酶）相比，添加胃蛋白酶时钙保留率保持在82%左右，延长的消化时间对钙保留率没有显著影响（P＞0.05）。结果表明，模拟的胃液对螯合物的稳定性影响很小，但对pH值敏感，并且在酸性条件下可使部分不稳定的结合钙解离成离子态。胃消化后，将先前的胃液与模拟肠液相结合进行二次消化。与0h（pH7.0、不添加脂肪酶）的模拟肠液相比，由于添加脂肪酶和随着消化时间的延长，钙保留率逐渐降低至（44.78±0.29）%，与对照组相比呈显著差异（P＜0.05）。研究肽螯合钙在人胃肠道中的环境稳定性，因为钙离子可能与植酸形成沉淀反应，并将结合的钙转变为胃液中的游离钙，从而导致钙生物利用度下降。
7EBCP-Ca对Caco-2细胞的细胞*性
如图6所示，0.、0.、0.、1.25、2.5、5mg/mL的EBCP-Ca作用于Caco-2细胞中没有显示出明显的细胞*性，且细胞存活率都在93%以上。当CaCl2质量浓度为0.mg/mL或更低质量浓度时，在Caco-2细胞中未表现出明显的细胞*性，但当质量浓度为0.mg/mL以上时，则逐渐降低了Caco-2细胞的活力（P＜0.05），随着加入量越大，对Caco-2细胞的存活率也就越低。
8Caco-2细胞中AKP活性和钙摄取率分析
检测每组Caco-2细胞的AKP活性。经过培养箱中孵育后，细胞AKP活性会急剧下降，这表明空白组削弱了Caco-2细胞的活性，而Caco-2细胞的活性通常是物质吸收和运输的主要原因。与对照组相比，在培养箱中培养4h后，模型组中Caco-2细胞的AKP活性显著降低（P＜0.05）。然而，暴露于不同培育时间和EBCP-Ca质量浓度的Caco-2细胞的AKP活性仍不低于正常组。钙对照组的细胞与模型组有显著差异（P＜0.05）。不同培养时间EBCP-Ca组对Caco-2细胞的AKP活性为（17.67±0.21）、（35.24±0.90）、（39.50±1.17）U/g和（43.43±0.66）U/g，而CaCl2组的AKP活性仅为（16.53±0.19）U/g，与对照组（（18.06±1.07）U/g）相比没有显著差异（P＞0.05），这表明钙对照组对Caco-2细胞的AKP活性没有积极作用。相反，添加EBCP-Ca可以有效提高小肠细胞中AKP的活性水平，进而维持小肠形成的活性，这有助于人类小肠消化吸收食物并增加AKP活性。研究Caco-2细胞培养中加入不同质量浓度EBCP-Ca组对细胞吸收钙质量浓度影响和加入3mg/mLEBCP-Ca在培养不同时间后细胞吸收钙质量浓度的变化，在培养箱中培养后，模型组中Caco-2细胞的钙质量浓度显著降低（P＜0.05）。第2小时和第4小时实验组的钙质量浓度超过正常水平（（0.42±0.00）mg/mL），分别达到（0.76±0.05）mg/mL和（0.91±0.01）mg/mL，补充EBCP-Ca可以减少钙的时间依赖性。随着EBCP-Ca质量浓度逐渐增加，细胞钙含量也增加，在Caco-2培养4h后，样品实验组的钙质量浓度均超过正常水平（（0.42±0.00）mg/mL），在细胞培养中补充EBCP-Ca剂量可以减少细胞对钙的剂量依赖性。相反，CaCl2组没有显示出优异的保护功效。尽管CaCl2组远高于模型组中的钙质量浓度（P＜0.05），但在2h和4h的所有不同质量浓度的实验组中，与EBCP-Ca相比，钙的保护作用仍存在较大差距失利。
结论
鳗鱼骨通过单酶、双酶和三酶结合水解，得到不同钙结合能力、水解度和肽产量的水解液，选择3种酶协同作用后的水解液，其值分别为（35.78±0.13）%、（40.96±0.24）%和（32.86±0.19）%，把水解液与CaCl2结合得到EBCP-Ca，并优化了钙螯合物的制备条件，通过优化确定EBCP-Ca的制备条件为40℃、pH7.5、40min、多肽与钙质量比5∶1，此时钙螯合率为80%以上。荧光光谱、FTIR光谱和SEM结果表明，钙离子可能与EBCP中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的氨基氮和羧酸基的氧原子相互作用形成EBCP-Ca，其结构不同于EBCP，但是CaCl2过量会出现荧光猝灭。EBCP-Ca可以在不同温度、pH值和模拟胃肠消化条件下保持稳定性，这可能有利于钙的吸收。
细胞*性实验表明，EBCP-Ca不会影响细胞的存活，而对照组CaCl2会影响细胞活性，加入量增加导致对细胞生长的影响增大，Caco-2细胞的存活率会显著降低（P＜0.05）。另外，使用Caco-2细胞单层模型在体外证实了EBCP-Ca的钙摄取率显著高于模型组和对照组（P＜0.05），钙离子与EBCP结合有助于细胞的吸收，效果优于CaCl2组。研究钙离子质量浓度与Caco-2细胞在不同质量浓度和时间下摄取的EBCP-Ca的AKP活性之间的关系，可以进一步维持小肠形成的活性，从而有助于人类小肠消化吸收食物中蛋白质，增加体内的AKP活性。结果表明，制备EBCP-Ca作为钙补充剂是提高鳗鱼骨利用率，增加附加值的途径之一。EBCP-Ca有利于促进钙吸收，作为营养补品具有潜在开发价值。应对鳗鱼骨水解物进行纯化、鉴定活性钙结合肽，以及促进肽钙螯合物吸收钙的确切机理和肽钙螯合物的体内钙吸收效率进行进一步研究。
本文《鳗鱼骨胶原肽钙螯合物的制备及其稳定性和Caco-2吸收特性》来源于《食品科学》年41卷24期1-8页，作者：钱跃威，徐瀚麟，吕奇晏，陈智超，滕慧，陈雷。DOI:10./spkx--0706-。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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